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1706室
1)、扩增曲线形状异常
a)、扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
b)、扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4),重新分析数据。
c)、个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡,由于温度升高后气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2)、反应结束无扩增曲线出现
a)、反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
b)、确认程序中是否设置了信号采集步骤:两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
c)、确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除引物降解的可能性。
d)、模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从******浓度做起。 e)、模板降解:重新制备模板,重复实验。
3)、Ct值出现太晚
a)、扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。
b)、模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从******浓度做起。
c)、模板降解:重新制备模板,重复实验。
d)、PCR产物太长:一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内。
e)、反应体系中存在PCR反应抑制剂:一般为加入模板时带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
4)、阴性对照也出现明显扩增
a)、反应体系或者水被污染:更换新的Mix或者水重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
b)、引物二聚体的出现:一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况,可配合融解曲线进行分析。
5)、******定量时标准曲线线性关系不佳
a)、加样误差:加大模板稀释倍数,提高加样体积。
b)、标准品降解:重新制备标准品,重复实验。
c)、模板浓度太高:增加模板稀释倍数。
6)、融解曲线出现多峰
a)、引物设计不够优化:根据设计原则设计新的引物。
b)、引物浓度太高:适当降低引物浓度。
c)、cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。
7)、实验重复性差
a)、加样体积失准:使用性能较好的移液枪,扩大反应体积,将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
b)、定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
c)、模板浓度太低:模板浓度越稀,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
8)、本产品是否可以4℃储存
a)、不可以。4℃保存将会导致产品活性下降。
b)、该产品-20℃保存可以长期保持活性,推荐-20℃保存。
c)、因反复冻融也可能导致产品活性下降,因此当每次用量较小时,推荐小体积分装后-20℃保存。
9)、预变性时间
本产品基于的AceTaqTM HS DNA Polymerase是化学修饰的热启动Taq酶,需要设置预变性温度为95℃,时间为至少5分钟,以充分释放酶活。如果模板的GC含量很高,可将预变性时间延长至10分钟。